Strukturelle und dynamische Untersuchung von Histon H2B im Bohrloch

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 672 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das H2A-H2B-Dimer ist ein Schlüsselbestandteil von Nukleosomen und ein wichtiger Akteur in der Chromatinbiologie. Hier haben wir die Struktur und Dynamik von H2B in präzipitierten Nukleosomenkernpartikeln (NCPs) mit einer physiologisch relevanten Konzentration mittels Festkörper-NMR charakterisiert. Unsere jüngste Untersuchung des H3-H4-Tetramers hat seine einzigartigen dynamischen Eigenschaften bestimmt und die vorliegende Arbeit liefert ein tieferes Verständnis der zuvor beobachteten dynamischen Netzwerke in NCP, das möglicherweise funktionell bedeutsam ist. Für H2B R30-A121 wurden nahezu vollständige 13C- und 15N-Zuordnungen erhalten, die die Extraktion beispiellos detaillierter struktureller und Aminosäure-ortsspezifischer Dynamiken ermöglichen. Die abgeleitete Struktur von H2B in der gut hydratisierten NCP-Probe stimmt gut mit der von Röntgenkristallen überein. Die Dynamik auf verschiedenen Zeitskalen wurde für H2B standortspezifisch halbquantitativ bestimmt. Insbesondere wird eine höhere Millisekunden-Mikrosekunden-Dynamik für H2B-Kernregionen beobachtet, einschließlich partiellem α1, L1, partiellem α2 und partiellem L3. Die Analyse dieser Regionen im Kontext der Tertiärstruktur zeigt die Häufung dynamischer Reste. Insgesamt schließt diese Arbeit eine Lücke zu einer vollständigen Resonanzzuordnung aller vier Histone in Nukleosomen und stellt dar, dass sich die dynamischen Netzwerke in NCP bis H2B erstrecken, was auf einen möglichen Mechanismus hindeutet, den Histonkern mit entfernter DNA zu koppeln, um die DNA-Aktivitäten zu modulieren.

Das scheibenförmige Nukleosomenkernpartikel (NCP) dient als Grundeinheit des Chromatins und wird durch die DNA organisiert, die um ein Histonoktamer gewickelt ist, das ein Komplex aus den Histonproteinen H2A, H2B, H3 und H4 ist1,2,3,4, welches durch Linker-DNA zu Chromatin verbunden ist. Das Histon-Octamer bietet eine stabile Plattform und bewahrt gleichzeitig die Plastizität, um die DNA-Regulierung zu unterstützen. Die Modulation der DNA-Aktivitäten wird durch verschiedene Mechanismen erreicht, darunter posttranslationale Modifikationen (PTMs)5,6,7,8, Einbau von Histonvarianten9,10 und Interaktionen mit Effektorproteinen11,12. Mit den jüngsten Fortschritten in den Techniken der Strukturbiologie konnten kürzlich wesentliche Strukturen von Nukleosomen und Nukleosomen-Protein-Komplexen mit atomarer Auflösung gelöst werden, was unser Verständnis der Genregulation erweitert1,13,14,15,16. Darüber hinaus wurde erkannt, dass die Dynamik von Nukleosomen und Subnukleosomen für die Chromatinbiologie von wesentlicher Bedeutung ist17,18,19,20. Chromatin ist sowohl auf mikro- als auch auf mesoskaliger Ebene ein hochdynamisches System, das durch die Regulierungsfaktoren gut moduliert wird, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten17,19. Jüngste Studien mit NMR, MD und FRET haben über Dynamiken im Mikromaßstab mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung für Nukleosomen18,21,22,23,24,25,26,27 berichtet und funktionelle dynamische Merkmale von Histonen und DNA in den Komplexen aufgedeckt. Darüber hinaus werden Phasentrennungsphänomene für Chromatin seit vielen Jahrzehnten untersucht28,29,30 und in jüngster Zeit erregte das Flüssig-Flüssig-Phasentrennungsverhalten von Chromatin große Aufmerksamkeit, da es möglicherweise neue Mechanismen der DNA-Regulation beschreibt, obwohl die In-vivo- und In-vitro-Ergebnisse umstritten sind Für diese biophysikalische Eigenschaft wurden 31,32,33 Daten erhalten, die auf weitere Untersuchungen warten. Festkörper-NMR (SSNMR) hat sich kürzlich als eine der hochauflösenden Techniken herausgestellt, die in der Lage ist, die Dynamik und Konformationsanordnung in der Chromatinbiologie aufzuklären22,34,35,36,37. Beispielsweise zeigt die SSNMR-Untersuchung von Nukleosomen-Arrays, die die Histon-H4-aa-K20-Monomethylierung (H4K20me1) enthalten, dass dieses PTM die Dynamik von Histonen erhöht und die Verdichtung von Nukleosomen-Arrays verringert, was seine Häufigkeit in transkriptionsaktiven Regionen erklärt38. Unsere vorherige Untersuchung der Nukleosomendynamik hat die Existenz dynamischer Netzwerke im H3-H4-Tetramer aufgeklärt, die aus einer Reihe von Resten bestehen. Diese Netzwerke ermöglichen die Kopplung zwischen den Histon-Kernregionen und der DNA und können epigenetische Signale von den Kernregionen an die entfernten DNA-Stellen übertragen. Eine ähnliche funktionelle Dynamik von Nukleosomen wurde kürzlich in einer MD-Studie berichtet, die eine 15-Mikrosekunden-Simulation eines NCP23 durchführte. Die Existenz dynamischer Netzwerke wird auch durch eine NMR-Studie im Lösungszustand von NCPs nahegelegt, die Acetylierungsstellen in den N-Schwänzen von H3 und H4 beherbergen. Allerdings ist das H2A-H2B-Dimer eine weitere Schlüsselkomponente in der Chromatinbiologie, und ein vollständiges Bild seiner dynamischen Eigenschaften im Nukleosomenkern fehlt noch. Die Entdeckung funktioneller dynamischer Eigenschaften des H3-H4-Tetramers in den Nukleosomen ermutigt uns, die H2A- und H2B-Histone im Histon-Octamer-Kern des Nukleosoms weiter zu charakterisieren, was fehlende Informationen über die funktionelle Dynamik von Nukleosomen liefern wird.

In der vorliegenden Arbeit haben wir SSNMR implementiert, um die Struktur und Dynamik des H2B-Proteins in gut hydratisierten NCPs zu untersuchen, die aus der Lösung ausgefällt wurden. Die NCP-Probe ist mit einer Konzentration von etwa 370 mg/ml stark hydratisiert, was physiologischen Bedingungen entspricht und im Bereich der Chromatinkonzentration in vivo (50–500 mg/ml) liegt41,42. Für alle R30-A121-Reste, die in den dipolaren Experimenten beobachtet werden, wurden mehrdimensionale 13C- und 15N-Zuordnungen erhalten. Die abgeleitete Sekundärstruktur der globulären Domäne von H2B im gut hydratisierten Nukleosomenpellet stimmt mit der XRD-Struktur des kristallisierten NCP überein. Das CANCO-Profil deutet auf eine halbquantifizierte Dynamik des H2B-Kerns im Millisekunden-Mikrosekunden-Zeitmaßstab hin, was darauf schließen lässt, dass sich eine der dynamischen Regionen in der Nähe der dynamischen H4-Domänen und ein anderer Cluster in der Nähe der DNA befindet. Die Ergebnisse legen nahe, dass sich die dynamischen Netzwerke auch auf H2B im NCP erstrecken, was möglicherweise entscheidend für die Modulation von DNA-Aktivitäten sein kann.

Eine NCP-Probe wurde aus der 145 bp großen Widom 601-DNA43 und dem HO, das einheitlich mit 13C, 15N markiertes H2B enthielt, rekonstituiert. Die NCP-Probe wurde mit 20 mM Mg2+ pelletiert, was zu einem maximalen Niederschlagsgrad und einer säulenförmigen hexagonalen Stapelstruktur führte44. Der Wassergehalt der SSNMR-Probe betrug 67 %, was anhand der Integrale des H2O-Signals und des Proteinsignals in einem 1H-SSNMR-Spektrum bestimmt wurde, was einer NCP-Konzentration von 370 mg/ml entspricht, die im Bereich der physiologischen Chromatinkonzentration liegt41. 42. Die Qualität der NCP-Probe wurde zunächst durch eindimensionale (1D) 1H-13C CP und zweidimensionale (2D) 13C-13C dipolar-unterstützte Rotationsresonanzexperimente (DARR)45 bewertet. Es wurde eine hohe Auflösung der SSNMR-Daten erhalten, wie durch das in Abb. 1 gezeigte Spektrum dargestellt, das eine ähnliche Qualität aufweist wie die in unseren jüngsten Studien an NCPs, die einheitlich markiertes H3 oder H422,46 enthalten. 2D DARR, NCA, NCO, NcaCX, dipolare Rückkopplung verstärkt durch Amplitudenmodulation (DREAM)47, dreidimensionale (3D) NCACX, NCOCX und CANCO wurden gesammelt, um zunächst die chemischen Verschiebungszuordnungen für Reste in der globulären Domäne von H2B in durchzuführen NCP. Die hohe Qualität der SSNMR-Spektren ermöglicht es uns, einen sequentiellen Backbone-Walk für H2B durchzuführen, wie in Abb. S1 dargestellt. Insgesamt werden mithilfe der dipolaren SSNMR-Daten nahezu vollständige 13C- und 15N-Resonanzzuordnungen für R30-A121 erhalten. Die anderen Reste in den H2B-N-Schwänzen fehlen in diesen dipolaren SSNMR-Spektren aufgrund ihrer hohen Flexibilität, was in den J-basierten SSNMR-INEPT-Experimenten nachgewiesen werden kann (Abb. S2). Die schematische Darstellung der zugewiesenen Spins ist in Abb. S3 dargestellt und die Zuweisungen sind in der BioMagResBank-Datenbank (Zugangsnummer 51820) hinterlegt. Diese Arbeit füllt die Lücke bei der Resonanzzuordnung von Histonproteinen in Nukleosomen, zusammen mit unserer vorherigen Charakterisierung von H346 und H422 und einer weiteren Arbeit von Xiang und Mitarbeitern zu H2A34, die zusammen SSNMR-Resonanzzuordnungen für alle vier Histonproteine im Nukleosomenkernpartikel liefert . Es muss darauf hingewiesen werden, dass die erhaltenen Zuordnungen von H2B für Xenopus laevis-Histone in dieser Arbeit gelten, die von H346 und H422 für Homo sapiens-Histone und die von H2A für Drosophila melanogaster in der vorherigen Studie34. Angesichts des hohen Niveaus der Kernhistonkonservierung in allen Arten ermöglichen uns die erhaltenen chemischen Verschiebungszuordnungen für die vier Histone in den meisten Szenarien den Zugriff auf molekulare Informationen durch NMR. Die Verfügbarkeit von Resonanzzuordnungen für Histonproteine in NCP ermöglicht die Verwendung von Festkörper- und Lösungs-NMR zur Untersuchung der Konformationen von Histonproteinen in Nukleosomen und Nukleosomen-Protein-Komplexen und liefert Signaturpeaks zur Extraktion der ortsspezifischen Dynamik von Aminosäuren.

2D-13C-13C-DARR-Spektrum von H2B im Mg2+-präzipitierten NCP. Die repräsentativen Teilpeakzuordnungen sind beschriftet. Bei der Datenerfassung wurde eine DARR-Mischzeit von 100 ms verwendet.

Die Sekundärstruktur von H2B in dieser NCP-Probe lässt sich leicht aus den chemischen Verschiebungszuordnungen ermitteln. Hier haben wir TALOS-N48 verwendet, um die Sekundärstruktur von H2B in der gut hydratisierten NCP-Pelletprobe vorherzusagen. Das Ergebnis ist in Abb. 2 dargestellt. Für die Aminosäurestellen R30-A121 werden vier Helixdomänen beobachtet, die durch drei Schleifen verbunden sind. Darüber hinaus existieren kurze Beta-Faltblattstrukturen in den L1- und L3-Schleifen. Diese abgeleiteten Sekundärstrukturen stimmen perfekt mit den XRD-Daten überein1,4. Die Reste A1-T29 und K122 fehlen in den dipolaren Festkörper-NMR-Spektren, was darauf hindeutet, dass sie im Vergleich zur globulären Domäne von H2B hochdynamisch sind, was mit den zufälligen Spulenstrukturen übereinstimmt. Insgesamt stimmen die durch unsere aktuelle SSNMR-Messung für H2B in dieser gut hydratisierten NCP-Probe erhaltenen Strukturinformationen mit den XRD-Strukturen überein.

eine TALOS-N-Vorhersage für H2B in NCP, die Primärsequenz von H2B R30-K122 ist oben dargestellt. b Schematische Darstellung der Sekundärstruktur von H2B, bestimmt mit der XRD-Methode (PDB: 3lz04).

Die vollständigen Resonanzzuordnungen der globulären Domäne von H2B ermöglichen die Extraktion der Aminosäure-ortsspezifischen dipolaren Kopplungsstärken aus 3D-Dipolar-Chemical-Shift-Korrelation (DIPSHIFT)49-Experimenten, von denen eine der Dimensionen die dipolare Dephasierungstrajektorie ist Die anderen beiden Dimensionen sind NCA-Ebenen zur Auflösung einzelner Aminosäurestellen. Die bewegungsgemittelten dipolaren 1H-13C- und 1H-15N-Kopplungskonstanten wurden durch Anpassen der experimentellen dipolaren Linienformen an simulierte Daten berechnet. Die berechneten Ordnungsparameter für Reste zwischen R30-A121, die im NCA-Spektrum aufgelöst werden können, sind in Abb. 3 dargestellt. Ordnungsparameterwerte der Rückgrat-(CH)α- und NH-Vektoren liegen im Bereich von 0,8–1,0 und schwanken eng dazwischen unterschiedliche Reste für die Stellen in den vier helikalen Regionen und den Schleifen L1 und L2. Die Reste R30 und K31 gehören zur N-terminalen Schwanzregion neben der α1-Helix, daher stimmen die Parameter niedrigerer kleinerer Ordnung mit der hochflexiblen Struktur des N-terminalen Schwanzes überein. In ähnlicher Weise besitzen die Reste T119 und A121 reduzierte Ordnungsparameter, was eine höhere Flexibilität auf der Mikrosekunden-Nanosekunden-Zeitskala von T119-K122 widerspiegelt, die zur kurzen C-terminalen Region und der angrenzenden partiellen αC-Helix gehören. Kleinere Werte der Ordnungsparameter werden auch für Reste in der L3-Schleife festgestellt, was zeigt, dass diese Domäne eine erhöhte Mobilität im Mikrosekunden-Nanosekunden-Zeitraum aufweist. Dies weist auf die erhöhte Plastizität des Zentrums des Histonkerns im NCP hin, wo die Packungsdichte geringer ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der enge Bereich der Ordnungsparameter, die für das Rückgrat des Großteils der globulären Domäne von H2B im NCP ermittelt wurden, auf eine starre und dichte strukturelle Packung der Histonfalten schließen lässt, die eine stabile Plattform für Aktivitäten der umhüllten DNA bietet. Darüber hinaus weisen die N-terminalen und C-terminalen Regionen erwartungsgemäß eine erhöhte Mobilität auf der Mikrosekunden-Nanosekunden-Zeitskala auf, und die L3-Region weist im Vergleich zum Großteil der globulären Domäne eine höhere Flexibilität auf.

a Dipolare Ordnungsparameter SNH und b S(CH)α für H2B im NCP bestimmt. Die schematische Darstellung der H2B-Sekundärstruktur ist oben dargestellt. Die experimentellen und simulierten Linienformen für alle Reste sind in den Abbildungen dargestellt. S4 und S5. Fehlerbalken sind berechnete 95 %-Konfidenzintervalle.

Unsere früheren Studien der H3- und H4-Proteine im NCP zeigten die Existenz dynamischer Netzwerke im Histonkern, die aus Aminosäureresten mit höherer Mobilität bestehen39. Diese Netzwerke verbinden die Histon-Kernregionen mit entfernten DNA-Stellen und können analog zur allosterischen Regulierung eine dominante Rolle bei der Regulierung von DNA-Aktivitäten spielen. Um ein vollständigeres Bild der Dynamik auf der Zeitskala von Millisekunden bis Mikrosekunden im Histonkern zu erhalten, bestimmen wir hier halbquantitativ die Mobilität für die H2B-Aminosäurereste im NCP. Abb. 4 zeigt die normalisierten CANCO-Intensitätspeaks für H2B-Reste, die in den 3D-Spektren gut aufgelöst werden können. Das dipolarbasierte CANCO-Experiment enthält zwei Magnetisierungstransferschritte durch CN-dipolare Kopplungswechselwirkungen. Folglich spiegeln die spektralen Spitzenintensitäten größtenteils die Mobilität auf der Zeitskala von Millisekunden bis Mikrosekunden wider. Das CANCO-Intensitätsprofil zeigt, dass einige Regionen eine relativ höhere Mobilität aufweisen. Unter den Resten, die in den dipolaren Experimenten nachgewiesen wurden, fehlen die Regionen K31-E32, V45-H46 und P100-G101 im CANCO-Spektrum, was ihre deutlich höhere Mobilität auf der Zeitskala von Millisekunden bis Mikrosekunden verdeutlicht. Es ist anzumerken, dass R30-K31 und S120-A121 auch in den CANCO-Spektren fehlen, was ebenfalls auf schnelle Bewegungen im Submikrosekundenbereich zurückzuführen ist, wie aus den aus den dipolaren Kopplungsmessungen erhaltenen Parametern kleinerer Ordnung hervorgeht. Darüber hinaus weist der Rest der kugelförmigen Domäne erhebliche Unterschiede in der Spitzenintensität zwischen verschiedenen Regionen auf, wie in Abb. 4 dargestellt. In einer aktuellen 15-Mikrosekunden-MD-Simulationsstudie wurden Mikrosekunden-Bewegungsereignisse beobachtet, die sowohl für Histonschwänze als auch für Histonkernregionen auftraten, was das Entpacken der DNA regelt23 . Daher sind Histon-N-terminale Schwänze neben den schnellen Nanosekunden-Mikrosekunden-Bewegungen wahrscheinlich auch an Bewegungen im Millisekunden-Mikrosekunden-Zeitmaßstab beteiligt. Als nächstes fassen wir die Reste von H2B zusammen, die eine relativ höhere Dynamik aufweisen, und untersuchen ihre Verbindungen mit dem dynamischen Netzwerk, das zuvor für die H3- und H4-Histone in NCP beobachtet wurde. In Abb. 5 entsprechen die rot und rosa hervorgehobenen Regionen Resten, die die höchste (in CANCO nicht vorhandene) Flexibilität und relativ höhere (mit geringerer CANCO-Intensität) Millisekunden-Mikrosekunden-Dynamik aufweisen. Zu den Regionen in H2B, die eine höhere Mobilität aufweisen, gehören hauptsächlich die N-terminale Region und die partiellen α1-, L1-, α2- und L3-Regionen sowie das C-terminale Ende. Wie in Abb. 5 dargestellt, gruppieren sich die N-terminale Region sowie die partiellen α1- und L1-Regionen und stehen in engem Kontakt mit der DNA. Interessanterweise befinden sich die Reste der partiellen α2-Region mit höherer Flexibilität in der Nähe der H4-α3-Region, von der in unserer vorherigen Arbeit festgestellt wurde, dass sie eine erhöhte Dynamik aufweist. Diese Häufung von Regionen mit höherer Mobilität lässt darauf schließen, dass sich die dynamischen Netzwerke des H3/H4-Tetramers auch auf das H2B/H2A-Dimer erstrecken, obwohl für H2A noch keine quantifizierten Dynamikdaten ermittelt wurden. Zwei weitere kurze Regionen mit höherer Mobilität sind die partielle L3-Region und das C-terminale Ende, von denen sich ersteres im Zentrum des Histonkerns mit geringer Packungsdichte befindet. Die höhere Dynamik dieser Regionen hängt wahrscheinlich mit ihren strukturellen Packungsmerkmalen zusammen.

Die CANCO-Peakhöhen werden als Funktion der Restanzahl aufgetragen. Die Peakhöhen werden auf den höchsten Wert im Datensatz normiert. Fehlerbalken werden aus den RMSD-Werten des CANCO-Spektralrauschens berechnet. Rote Punkte zeigen Reste in der globulären H2B-Domäne an, deren CANCO-Peaks zwischen den Resten im Spektrum fehlen. Als Orientierungshilfe für die Visualisierung wird eine rote gestrichelte Linie gezeichnet, die einem Y-Achsenwert von 0,5 entspricht.

Die dynamischen Reste, die denen entsprechen, die null oder schwächere 3D-CANCO-Peaksignale (normalisierte Intensität < 0,5) zeigen, werden in der NCP-Struktur rot bzw. rosa hervorgehoben. Unten werden vergrößerte Bilder von zwei Regionen angezeigt, die geclusterte dynamische Reste enthalten. Im unteren rechten Bereich sind auch die Seitenketten der dynamischen Reste in H2B α2 und H4 α3 dargestellt, um ihre räumlichen Kontakte zu veranschaulichen. Einige Rückstände sind markiert, um die relative Lage verschiedener Regionen leichter identifizieren zu können.

Chromatin ist ein hochdynamischer DNA-Protein-Komplex, dessen Struktur und Dynamik durch verschiedene Faktoren reguliert wird. Die Dynamik des Chromatins sowohl auf mikroskaliger als auch auf mesoskaliger Ebene ist für seine biologischen Funktionen von entscheidender Bedeutung. Die früheren Studien von uns und anderen Gruppen deuteten auf eine signifikante funktionelle Relevanz von Millisekunden-Mikrosekunden-Zeitskalen in Nukleosomen und auf die Existenz dynamischer Netzwerke hin, die möglicherweise eine Kopplung zwischen den Histon-Kernregionen fernab von DNA-Stellen ermöglichen, was möglicherweise die Übertragung von Signalen vorantreiben könnte, die von ihnen erzeugt werden Veränderungen wie epigenetische Modifikationen. In dieser Arbeit führten wir eine SSNMR-Studie durch, um die Struktur und interne Dynamik des H2B-Histons in NCP mit einer nahezu physiologischen Konzentration zu untersuchen. Die erhaltenen 13C- und 15N-chemischen Verschiebungszuordnungen von H2B stellen eine vollständige Datenbank für chemische Verschiebungszuordnungen für alle vier Histone in Nukleosomen zur Verfügung. Das H2B in diesem gut hydratisierten NCP-Pellet faltet sich in die gleiche Struktur, wie zuvor durch XRD-Studien bestimmt. Aus den Messungen der dipolaren Kopplungskonstante und dem CANCO-Peakintensitätsprofil abgeleitete Ordnungsparameter liefern ortsspezifische Informationen über die Dynamik auf den Zeitskalen Mikrosekunden-Nanosekunden und Millisekunden-Mikrosekunden für H2B in NCP. Die Mehrheit der globulären Domänen besitzt eine ähnliche Mikrosekunden-Nanosekunden-Mobilität, was auf eine stabile und kompakte Histon-Kernregion schließen lässt. Es wurde beobachtet, dass mehrere Regionen im H2B-Kern eine relativ höhere Millisekunden-Mikrosekunden-Dynamik aufweisen, von denen eine in engem Kontakt mit der DNA steht und die anderen Cluster zusammen mit einem der dynamischen H3-H4-Netzwerke. Dies zeigt, dass dynamische Netzwerke auch in den H2A-H2B-Dimeren existieren und möglicherweise mit denen im H3-H4-Tetramer und mit DNA interagieren. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat die vorhergesagten Ordnungsparameter mithilfe der Random-Coil-Index-Methode (RCI) für H2A in einem NCP34 angegeben. Die experimentelle Bestimmung der H2A-Dynamik fehlt jedoch noch. Eine Studie zur H2A-Dynamik auf verschiedenen Zeitskalen wartet auf zukünftige Studien, um das Gesamtbild der dynamischen Netzwerke im Nukleosom aufzuklären. Insgesamt liefert die aktuelle Arbeit eine unschätzbar wertvolle Charakterisierung der internen Dynamik von Histonen in Nukleosomen und wichtige Fingerabdruckspektren für zukünftige NMR-Studien von Chromatin.

Die letzte Information, nämlich die Dynamik von H2A, fehlt noch für ein umfassenderes Verständnis der Dynamik des Histonkerns in Nukleosomen. Darüber hinaus wurde die Dynamik semiquantitativ und nur für Aminosäurerückgratreste ermittelt. Zukünftige Experimente mit anderen SSNMR-Techniken50,51 oder in Kombination mit MD-Simulationen können durchgeführt werden, um die Bewegungen von Aminosäureseitenketten und DNA mit einer höheren räumlichen und zeitlichen Auflösung aufzuklären, obwohl solche Experimente für diese großen Komplexe eine Herausforderung darstellen. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der funktionellen Relevanz der für das Nukleosom beobachteten dynamischen Netzwerke weitere parallele biologische Studien, ähnlich wie in unserer jüngsten Arbeit38.

Histonproteine wurden vom pLysS-Stamm Escherichia coli BL 21 (DE3) überexprimiert. Die Zellkultur wurde in 2x YT-Medium bei 37 °C gezüchtet, bis die OD600 0,5 erreichte, und wurde dann mit 0,4 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden nach 3-stündiger Inkubation bei 37 °C geerntet. Die Einschlusskörper wurden extrahiert und in Entfaltungspuffer gelöst, der 7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Natriumacetat (pH 5,2), 10 mM DTT (oder 20 mM DTT für die H3-Herstellung verwendet) enthielt. Die rohe Histonlösung wurde anschließend mit einer HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR-Säule (GE Healthcare) gereinigt und die Elutionsfraktionen wurden gegen Milli-Q-Wasser mit 5 mM Beta-Mercaptoethanol dialysiert. Für Histonfraktionen mit DNA-Kontamination erfolgt ein zweiter Reinigungsschritt durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer RESOURCE S-Säule (Cytiva). Die gereinigten Proteine wurden lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Um das mit Isotopen 13C und 15N markierte Xenopus laevis H2B zu erhalten, wurden die Zellen zunächst in 2x YT-Medium gezüchtet, bis die OD 0,5 erreichte, und dann bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die gesammelten Zellen wurden in M9-Medium mit 2 g/L 13C-Glucose und 1 g/L 15N-NH4Cl resuspendiert und vor der Induktion mit 0,4 mM IPTG eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert.

Um das Histonoktamer (HO) herzustellen, wurden das lyophilisierte 13C, 15N markierte Xenopus laevis H2B und die natürlich vorkommenden Homo sapiens H2A, H3 und H4 in Entfaltungspuffer gelöst, der 7 M Guanidinium HCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 enthielt mM DTT (20 mM DTT für H3). Die Lösung von vier verschiedenen Histonen wurde im äquimolaren Verhältnis gemischt. Die Mischung wurde gegen den Rückfaltungspuffer, der 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Natrium-EDTA und 5 mM Beta-Mecaptoethanol enthielt, bei 4 °C dialysiert. Die erhaltene H O-Lösung wurde durch FPLC-Gelfiltration unter Verwendung einer HiLoad 16/60 Superdex-Säule mit 200 pg (GE Healthcare) gereinigt. Die Fraktionen wurden mit 18 % SDS-Gel ausgewertet (Abb. S6) und das reine H O für die anschließende Rekonstitution kombiniert.

Die 145 bp große Widom 601-DNA wurde durch Amplifikation eines pUC19-Plasmids, das acht Kopien der DNA-Fragmente enthielt, mit dem Stamm DH5α erhalten. Die Zellen wurden in TB-Medium gezüchtet und nach 21-stündigem Wachstum bei 37 °C geerntet. Die Plasmide wurden mit der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit EcoRV-HF (NEB) verdaut. Die 145 bp 601-DNA wurde mittels Polyethylenglykolfraktionierung vom Rückgratvektor abgetrennt.

NCP wurde mit der herkömmlichen Salzgradientendialysemethode rekonstituiert52. Die DNA und HO, die einheitlich 13C, 15N markiertes H2B enthielten, wurden in einem Ausgangspuffer gemischt, der 2 M KCl, 1 mM EDTA und 1 mM DTT enthielt. Die Mischung wurde in einen 3-kDa-Dialysebeutel überführt und in den Startpuffer gegeben, der mit einer Schlauchpumpe für 20–24 Stunden bei einer Flussrate von 0,5 ml/min bei Raumtemperatur ständig entfernt und durch den Puffer ohne KCl ersetzt wird. Anschließend wurde die Mischung weitere 2–3 Stunden lang gegen den Puffer ohne KCl dialysiert, um sicherzustellen, dass die KCl-Konzentration unter 0,2 M lag. Das rekonstituierte Produkt wurde durch 6 % native PAGE und 18 % SDS-PAGE bewertet (Abb. S6).

Das rekonstituierte NCP, das einheitlich mit 13C, 15N markiertes H2B enthält, wurde in Puffer mit 20 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, <0,2 M KCl (aus Salzgradientendialyse) auf 3 mg/ml konzentriert und in ein SSNMR übertragen Mit einem Probenladegerät (Giotto tech) wurde 1 M MgCl2 der NCP-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Mg2+ zugesetzt, um eine maximale NCP-Ausfällung zu induzieren. Die Probe wurde 2–3 Stunden lang bei 4 °C und 100.000 xg zentrifugiert, um das NCP-Pellet auf einen 3,2-mm-SSNMR-Rotor zu schleudern.

Alle SSNMR-Experimente wurden auf einem 18,8 T Bruker Advance III HD-Spektrometer durchgeführt, das mit einer 3,2 mm EFree-Sonde ausgestattet war. Die Magic Angle Spinning (MAS)-Rate betrug 15151 Hz und die Temperatur wurde mit einer BCU-II-Einheit reguliert, um die Probentemperatur bei 12 °C zu halten, die mit Ethylenglykol kalibriert wurde53. 2D-CC-DARR mit unterschiedlichen Mischzeiten, 2D-CC-dipolare Rückkopplung verstärkt durch DREAM-Schema, 2D-NcaCX, 3D-NCACX, NCOCX und CANCO wurden durchgeführt, um 13C- und 15N-Zuordnungen zu erhalten. 3D-DIPSHIFT-Experimente unter Verwendung von R1214,54,55-Symmetriesequenzen auf dem 1H-Kanal in einer konstanten Zeitweise wurden durchgeführt, um 1H-13C- und 1H-15N-Dipollinienformen zu extrahieren. Die detaillierten experimentellen Parameter sind in Tabelle S1 in den Zusatzinformationen aufgeführt. Die Daten wurden mit NMRPipe56 verarbeitet und mit SPARKY (TD Goddard und DG Kneller, University of California, San Francisco) analysiert. Die 13C-chemischen Verschiebungen wurden unter Verwendung von Adamantin als externem Standard referenziert, wobei das Downfield-Kohlenstoffsignal auf 40,48 ppm57 eingestellt war, und die 15N-chemische Verschiebungsreferenz wurde indirekt berechnet. Die dipolaren Rückkopplungsbahnen 1H-13C und 1H-15N wurden in NMRPipe extrahiert und mit SIMPSON58 angepasst.

3D-NCACX-, NCOCX- und CANCO-Experimente wurden 10–16 Mal gesammelt und zur Analyse zusammenaddiert. 3D-DIPSHIFT-Experimente wurden 13–14 Mal durchgeführt und zur Analyse zusammenaddiert. Die Abweichungen der Fehlerbalken für die in Abb. 3 dargestellten und die in Abb. 4 dargestellten Ordnungsparameter werden in den entsprechenden Bildunterschriften beschrieben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die vollständigen Zuordnungen der chemischen Verschiebungen, die in dieser Arbeit erhalten wurden, sind in der BioMagResBank-Datenbank unter der Zugangsnummer 51820 verfügbar. Daten zur Erstellung der Abb. 2, 3 und 4 sind als ergänzende Daten verfügbar und alle übrigen Informationen können auf begründete Anfrage von den entsprechenden Autoren eingeholt werden.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (an XS, Fördernummer: 32201006), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Provinz Guangdong (an XS, Fördernummer: 2021QN02Y103, 2022A0505030002) und dem Bildungsministerium von Guangdong Provinz (bis XS, Fördernummer: 2022ZDZX061). Ein Zuschuss der Stufe 2 (MOE2018-T2-1-112) des Singapore Ministry of Education Academic Research Fund (AcRF) unterstützte die Arbeit im LN-Labor. Alle SSNMR-Experimente wurden am Zentrum für Hochfeld-NMR-Spektroskopie und Bildgebung der Nanyang Technological University (NTU) durchgeführt. Wir danken auch dem NTU Institute of Structural Biology (NISB) für die Unterstützung dieser Forschung.

Chinmayi Prasanna

Aktuelle Adresse: Abteilung für Physiologie und Biophysik, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, USA

Abteilung für Biologie, Shenzhen MSU-BIT University, Shenzhen, Provinz Guangdong, China

Xiangyan Shi

School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapur, Singapur

Bhuvaneswari Kannaian, Chinmayi Prasanna, Aghil Soman und Lars Nordenskiöld

NTU-Institut für Strukturbiologie, Nanyang Technological University, Singapur, Singapur

Lars Nordenskiöld

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Konzeptualisierung und Studiendesign: XS und LN Erfassung und Analyse von SSNMR-Daten: XS Probenvorbereitung: BK, CP und AS Verfassen und Bearbeiten von Manuskripten: XS und LN

Korrespondenz mit Xiangyan Shi oder Lars Nordenskiöld.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Paul Schanda und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Joanna Timmins und Anam Akhtar und George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Shi, X., Kannaian, B., Prasanna, C. et al. Strukturelle und dynamische Untersuchung von Histon H2B in gut hydratisierten Nukleosomenkernpartikeln mittels Festkörper-NMR. Commun Biol 6, 672 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05050-3

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Eingegangen: 19. Februar 2023

Angenommen: 16. Juni 2023

Veröffentlicht: 24. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05050-3

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